Důkazem identity v certifikátu analýzy je měření hmotnosti. Článek Jak číst sekvenci peptidu vysvětluje, jak ze sekvence vypočítat teoretickou hmotnost. Tento článek začíná tam, kde onen končí: u samotného spektra.
Co znamená osa x
Hmotnostní spektrometr neměří hmotnost, ale poměr hmotnosti k náboji: m/z. Proto je na ose x m/z, a ne dalton. U jednou nabité částice jsou obě hodnoty téměř stejné, u částice se třemi náboji se liší trojnásobně. Každý pík tedy klade dvě otázky: jaká hmotnost a jaký náboj?
Dva způsoby ionizace
Molekula musí nejprve získat náboj a dostat se do plynné fáze, aniž by se rozpadla. U velkých biomolekul to byla dlouho překážka. V roce 2002 získali polovinu Nobelovy ceny za chemii John B. Fenn a Koichi Tanaka „za vývoj měkkých desorpčních ionizačních metod pro hmotnostně spektrometrické analýzy biologických makromolekul“; druhá polovina připadla Kurtu Wüthrichovi za práci s nukleární magnetickou rezonancí. Fenn pracoval s ionizací elektrosprejem (ESI), při níž se roztok rozprašuje v elektrickém poli; Tanaka ukázal, že funguje i laserová desorpce, tedy přístup používaný v metodě MALDI.
Na tom, kterou z těchto dvou metod certifikát uvádí, závisí, jak spektrum vypadá. Při elektrospreji peptid přijme jeden nebo více protonů a obvykle vidíte řadu píků téže molekuly.
Řady nábojů
Protonovaný peptid se zapisuje jako [M+zH]z+: neutrální hmotnost M plus z protonů, rozložených na z nábojů. PubChem uvádí pro proton (vodíkový kationt) monoizotopovou hmotnost 1,00783. Díky tomu můžete vypočítat m/z každého nábojového stavu. Vezměme BPC-157 s monoizotopovou hmotností 1 418,704 podle databáze PubChem:
| Iont | Výpočet | m/z |
|---|---|---|
| [M+H]+ | (1 418,704 + 1,008) / 1 | 1 419,71 |
| [M+2H]2+ | (1 418,704 + 2 × 1,008) / 2 | 710,36 |
| [M+3H]3+ | (1 418,704 + 3 × 1,008) / 3 | 473,91 |
Funguje to stejně dobře i obráceně: z píku při m/z 710,36 s nábojem 2 vyplývá, že M = 2 × 710,36 – 2 × 1,008 = 1 418,70. Zpětný přepočet z m/z na neutrální hmotnost se nazývá dekonvoluce. Provádí ji software, ale stačí i dva píky a kalkulačka.
Monoizotopová, nebo průměrná
PubChem uvádí pro každou sloučeninu dvě hmotnosti. U BPC-157 je to 1 418,70 monoizotopová a 1 419,5 průměrná. Monoizotopová hmotnost patří molekule, v níž je každý atom nejběžnějším izotopem; průměrná hmotnost zohledňuje přirozené zastoupení všech izotopů, a je proto o něco vyšší.
Kterou z těchto dvou hodnot certifikát uvádí, by v něm mělo být uvedeno. Rozdíl téměř jedné jednotky není u malého peptidu chyba zaokrouhlení a u dlouhého řetězce se rozdíl zvětšuje. Vždy proto porovnávejte stejné se stejným.
Izotopový vzor
Při dostatečném rozlišení není pík peptidu čára, ale malý shluk. Je to proto, že část molekul obsahuje těžší izotop, především uhlík-13. Každý další izotop zvyšuje hmotnost molekuly přibližně o jednu hmotnostní jednotku a na ose m/z se tato jednotka dělí nábojem. Rozestup mezi píky ve shluku je tedy přibližně 1 při náboji 1, přibližně 0,5 při náboji 2 a přibližně 0,33 při náboji 3. Náboj tak můžete vyčíst přímo ze vzoru.
Píky, které k peptidu nepatří
Ne každý pík je nečistota. Peptid může místo protonu přijmout také iont sodíku nebo draslíku. S hodnotami z databáze PubChem lze posun přesně určit. Pro BPC-157:
- [M+Na]+ při m/z 1 441,69. Sodík váží 22,990, tedy o 21,98 více než proton.
- [M+K]+ při m/z 1 457,67. Draslík váží 38,964, tedy o 37,96 více než proton.
Jiné posuny ukazují na chemickou změnu samotného peptidu. Manning a kolegové (Pharmaceutical Research, 2010) popisují reakce, které za nimi stojí:
- Oxidace: jeden atom kyslíku navíc. PubChem uvádí atom kyslíku jako 15,995, tedy přibližně +16 na každý oxidovaný postranní řetězec.
- Deamidace: amidová skupina (NH2) se mění na kyselou skupinu (OH). Tento rozdíl je přesně rozdílem mezi vodou (18,0106) a amoniakem (17,0265) v databázi PubChem: +0,98, v praxi přibližně +1.
- Ztráta vody: -18,01, hmotnost jedné molekuly vody podle databáze PubChem.
- Chybějící aminokyselina: posun dolů o hmotnost tohoto zbytku, což je hmotnost volné aminokyseliny minus jedna molekula vody. Pro prolin uvádí PubChem 115,063; po odečtení 18,011 je to 97,05.
Odkud tyto vedlejší produkty při syntéze pocházejí, popisuje článek Jak se peptidy vyrábějí?; jak zabránit jejich vzniku při skladování, popisuje článek Skladování peptidů v laboratoři.
Dva příklady z praxe
Jeden název, dvě sloučeniny. V tomto katalogu je TB-500 fragment Ac-LKKTETQ s molekulovou hmotností 889,0 podle databáze PubChem. Celý protein thymosin beta-4 má v databázi PubChem hmotnost přibližně 4 963. Měření hmotnosti tak okamžitě rozhodne, která z těchto dvou látek je v lahvičce, i když štítek používá stejný název.
S DAC, nebo bez DAC. CJC-1295 existuje ve dvou formách: s DAC s molekulovou hmotností 3 647,2 a bez DAC s hmotností 3 367,9. Rozdíl téměř 280 nelze ve spektru přehlédnout.
Ve směsi by měla mít každá složka vlastní hmotnost; tím se zabývá článek Směsi peptidů ve výzkumu.
Hmotnostní spektrum nikdy nestojí v certifikátu samo: čistota vyplývá z chromatogramu a identita ze spektra. Jak obojí společně popisuje šarži, vysvětlují články Co je certifikát COA? a Co znamená čistota 99 %? Certifikáty k našim šaržím najdete na stránce Výsledky analýz.
Zdroje
Navštíveno v listopadu 2026.
- The Nobel Prize in Chemistry 2002 (Nobel Prize Outreach): John B. Fenn a Koichi Tanaka s odůvodněním týkajícím se měkkých desorpčních ionizačních metod a Kurt Wüthrich za nukleární magnetickou rezonanci
- Hydrogen cation (PubChem), CID 1038: monoizotopová hmotnost 1,00783
- Sodium ion (PubChem), CID 923: 22,98977, a Potassium cation, CID 813: 38,96371
- Water (PubChem), CID 962: 18,01056, Ammonia, CID 222: 17,02655, a Atomic oxygen, CID 159832: 15,99491
- L-Proline (PubChem), CID 145742: 115,063
- BPC-157 (PubChem), CID 9941957: 1 418,704 monoizotopová a 1 419,5 průměrná
- TB-500 (Ac-LKKTETQ) (PubChem), CID 62707662: 889,0, a Thymosin Beta 4, CID 45382195: přibližně 4 963
- CJC-1295 (with DAC) (PubChem), CID 91971820: 3 647,2, a CJC-1295 without DAC, CID 56841945: 3 367,9
- Manning M.C. et al. (2010), Stability of protein pharmaceuticals: an update, Pharmaceutical Research (PubMed), PMID 20143256: oxidace, deamidace a hydrolýza
Tento článek poskytuje základní informace o laboratorním výzkumu. Nejde o lékařskou radu ani o návod k použití. Všechny produkty jsou určeny výhradně pro výzkumné účely.
