Het identiteitsbewijs op een analysecertificaat is een massameting. In Hoe lees je een peptidesequentie? staat hoe je de theoretische massa uit de sequentie berekent. Dit artikel begint waar dat ophoudt: bij het spectrum zelf.
Wat de x-as betekent
Een massaspectrometer meet geen massa, maar de verhouding tussen massa en lading: m/z. Daarom staat er op de x-as m/z en niet dalton. Voor een deeltje met één lading zijn die twee bijna hetzelfde, voor een deeltje met drie ladingen scheelt het een factor drie. Elke piek vraagt dus twee vragen: welke massa, en welke lading?
Twee manieren om te ioniseren
Een molecuul moet eerst een lading krijgen en in de gasfase komen zonder uit elkaar te vallen. Voor grote biomoleculen was dat lang het struikelblok. In 2002 ging de helft van de Nobelprijs voor de Scheikunde naar John B. Fenn en Koichi Tanaka “for their development of soft desorption ionisation methods for mass spectrometric analyses of biological macromolecules”; de andere helft ging naar Kurt Wüthrich voor werk met kernspinresonantie. Fenn werkte met elektrosprayionisatie (ESI), waarbij een oplossing in een elektrisch veld wordt verneveld; Tanaka toonde dat laserdesorptie ook werkt, de aanpak die in MALDI wordt gebruikt.
Welke van de twee op een certificaat staat, bepaalt hoe het spectrum eruitziet. Bij elektrospray neemt een peptide een of meer protonen op en zie je meestal een reeks pieken van hetzelfde molecuul.
Ladders van ladingen
Een geprotoneerd peptide schrijf je als [M+zH]z+: de neutrale massa M plus z protonen, verdeeld over z ladingen. PubChem geeft voor het proton (het waterstofkation) een monoisotopische massa van 1,00783. Daarmee is de m/z van elke ladingstoestand uit te rekenen. Neem BPC-157, met een monoisotopische massa van 1418,704 volgens PubChem:
| Ion | Rekenwijze | m/z |
|---|---|---|
| [M+H]+ | (1418,704 + 1,008) / 1 | 1419,71 |
| [M+2H]2+ | (1418,704 + 2 × 1,008) / 2 | 710,36 |
| [M+3H]3+ | (1418,704 + 3 × 1,008) / 3 | 473,91 |
Omgekeerd werkt het net zo goed: uit een piek bij m/z 710,36 met lading 2 volgt M = 2 × 710,36 – 2 × 1,008 = 1418,70. Dat terugrekenen van m/z naar de neutrale massa heet deconvolutie. Software doet het, maar met twee pieken en een rekenmachine kom je er ook.
Monoisotopisch of gemiddeld
PubChem geeft per stof twee massa’s. Voor BPC-157 is dat 1418,70 monoisotopisch en 1419,5 gemiddeld. De monoisotopische massa hoort bij het molecuul waarin elk atoom de meest voorkomende isotoop is; de gemiddelde massa houdt rekening met de natuurlijke verdeling van alle isotopen en ligt daarom iets hoger.
Welke van de twee op een certificaat staat, hoort erbij te staan. Een verschil van bijna één eenheid is bij een kleine peptide geen afrondingsfout, en bij een lange keten loopt het verschil verder op. Vergelijk dus steeds dezelfde soort massa met dezelfde soort massa.
Isotopenpatroon
Een piek van een peptide is bij voldoende resolutie geen streep maar een groepje. Dat komt doordat een deel van de moleculen een zwaarder isotoop bevat, vooral koolstof-13. Elk extra isotoop maakt het molecuul ongeveer één massa-eenheid zwaarder, en op de m/z-as wordt die eenheid door de lading gedeeld. De afstand tussen de pieken in het groepje is dus ongeveer 1 bij lading 1, ongeveer 0,5 bij lading 2 en ongeveer 0,33 bij lading 3. Zo lees je de lading rechtstreeks uit het patroon af.
Pieken die niet bij het peptide horen
Niet elke piek is een onzuiverheid. Een peptide kan ook een natrium- of kaliumion oppakken in plaats van een proton. Met de waarden van PubChem is de verschuiving precies te benoemen. Voor BPC-157:
- [M+Na]+ bij m/z 1441,69. Natrium weegt 22,990, dus 21,98 meer dan het proton.
- [M+K]+ bij m/z 1457,67. Kalium weegt 38,964, dus 37,96 meer dan het proton.
Andere verschuivingen wijzen op een chemische verandering van het peptide zelf. Manning en collega’s (Pharmaceutical Research, 2010) beschrijven de reacties erachter:
- Oxidatie: een extra zuurstofatoom. PubChem geeft voor het zuurstofatoom 15,995, dus ongeveer +16 per geoxideerde zijketen.
- Deamidatie: een amidegroep (NH2) wordt een zuurgroep (OH). Dat verschil is precies het verschil tussen water (18,0106) en ammoniak (17,0265) in PubChem: +0,98, in de praktijk ongeveer +1.
- Waterverlies: -18,01, de massa van één watermolecuul volgens PubChem.
- Een ontbrekend aminozuur: een verschuiving naar beneden ter grootte van dat residu, en die is de massa van het vrije aminozuur min één watermolecuul. Voor proline geeft PubChem 115,063; min 18,011 is dat 97,05.
Waar die bijproducten in de synthese vandaan komen, staat in Hoe worden peptiden gemaakt?; hoe je ze in opslag voorkomt, in Peptiden bewaren in het lab.
Twee voorbeelden uit de praktijk
Een naam, twee stoffen. TB-500 is in de catalogus het fragment Ac-LKKTETQ met een molecuulmassa van 889,0 volgens PubChem. Het volledige eiwit thymosine bèta-4 heeft in PubChem een massa van ongeveer 4963. Een massameting beslist dus meteen welke van de twee in het flesje zit, ook als het etiket dezelfde naam gebruikt.
Met of zonder DAC. CJC-1295 bestaat in twee vormen: met DAC, met een molecuulmassa van 3647,2, en zonder DAC, met 3367,9. Een verschil van bijna 280 is in een spectrum niet te missen.
In een blend hoort elk onderdeel zijn eigen massa te hebben; daarover gaat Peptideblends in onderzoek.
Een massaspectrum staat nooit alleen op een certificaat: de zuiverheid komt uit het chromatogram en de identiteit uit het spectrum. Hoe die twee samen een batch beschrijven, staat in Wat is een COA? en Wat betekent 99% zuiverheid? De certificaten van onze batches staan bij Labresultaten.
Bronnen
Geraadpleegd in november 2026.
- The Nobel Prize in Chemistry 2002 (Nobel Prize Outreach): John B. Fenn en Koichi Tanaka, met de motivering over zachte desorptie-ionisatiemethoden, en Kurt Wüthrich voor kernspinresonantie
- Hydrogen cation (PubChem), CID 1038: monoisotopische massa 1,00783
- Sodium ion (PubChem), CID 923: 22,98977, en Potassium cation, CID 813: 38,96371
- Water (PubChem), CID 962: 18,01056, Ammonia, CID 222: 17,02655, en Atomic oxygen, CID 159832: 15,99491
- L-Proline (PubChem), CID 145742: 115,063
- BPC-157 (PubChem), CID 9941957: 1418,704 monoisotopisch en 1419,5 gemiddeld
- TB-500 (Ac-LKKTETQ) (PubChem), CID 62707662: 889,0, en Thymosin Beta 4, CID 45382195: ongeveer 4963
- CJC-1295 (met DAC) (PubChem), CID 91971820: 3647,2, en CJC-1295 zonder DAC, CID 56841945: 3367,9
- Manning M.C. et al. (2010), Stability of protein pharmaceuticals: an update, Pharmaceutical Research (PubMed), PMID 20143256: oxidatie, deamidatie en hydrolyse
Dit artikel is achtergrondinformatie over laboratoriumonderzoek. Het is geen medisch advies en geen gebruiksaanwijzing. Alle producten zijn uitsluitend voor onderzoek.
