Dowodem tożsamości na certyfikacie analizy jest pomiar masy. Artykuł Jak czytać sekwencję peptydu wyjaśnia, jak obliczyć masę teoretyczną na podstawie sekwencji. Niniejszy artykuł zaczyna się tam, gdzie tamten się kończy: od samego widma.
Co oznacza oś x
Spektrometr mas nie mierzy masy, lecz stosunek masy do ładunku: m/z. Dlatego na osi x widnieje m/z, a nie dalton. Dla cząstki o pojedynczym ładunku obie wartości są niemal takie same; dla cząstki o trzech ładunkach różnią się trzykrotnie. Każdy pik stawia więc dwa pytania: jaka masa i jaki ładunek?
Dwa sposoby jonizacji
Cząsteczka musi najpierw przyjąć ładunek i przejść w fazę gazową, nie rozpadając się. W przypadku dużych biocząsteczek przez długi czas była to główna przeszkoda. W 2002 roku połowę Nagrody Nobla w dziedzinie chemii otrzymali John B. Fenn i Koichi Tanaka „for their development of soft desorption ionisation methods for mass spectrometric analyses of biological macromolecules”; drugą połowę otrzymał Kurt Wüthrich za prace z zakresu magnetycznego rezonansu jądrowego. Fenn pracował z jonizacją przez elektrorozpylanie (ESI), w której roztwór jest rozpylany w polu elektrycznym; Tanaka wykazał, że działa również desorpcja laserowa, czyli podejście stosowane w MALDI.
To, którą z tych dwóch metod podaje certyfikat, wpływa na wygląd widma. Przy elektrorozpylaniu peptyd przyjmuje jeden lub więcej protonów i zwykle widać serię pików pochodzących od tej samej cząsteczki.
Drabiny ładunków
Protonowany peptyd zapisuje się jako [M+zH]z+: masa obojętna M plus z protonów, rozłożonych na z ładunków. PubChem podaje dla protonu (kationu wodoru) masę monoizotopową 1,00783. Na tej podstawie można obliczyć m/z każdego stanu naładowania. Weźmy BPC-157 o masie monoizotopowej 1418,704 według PubChem:
| Jon | Obliczenie | m/z |
|---|---|---|
| [M+H]+ | (1418,704 + 1,008) / 1 | 1419,71 |
| [M+2H]2+ | (1418,704 + 2 × 1,008) / 2 | 710,36 |
| [M+3H]3+ | (1418,704 + 3 × 1,008) / 3 | 473,91 |
Działa to równie dobrze w odwrotną stronę: z piku przy m/z 710,36 o ładunku 2 wynika, że M = 2 × 710,36 – 2 × 1,008 = 1418,70. Przeliczanie m/z z powrotem na masę obojętną nazywa się dekonwolucją. Wykonuje ją oprogramowanie, ale dwa piki i kalkulator również wystarczą.
Monoizotopowa czy średnia
PubChem podaje dla każdego związku dwie masy. Dla BPC-157 jest to 1418,70 (monoizotopowa) i 1419,5 (średnia). Masa monoizotopowa odnosi się do cząsteczki, w której każdy atom jest najczęściej występującym izotopem; masa średnia uwzględnia naturalny rozkład wszystkich izotopów i jest dlatego nieco wyższa.
To, którą z nich podaje certyfikat, powinno być na nim wskazane. Różnica wynosząca prawie jedną jednostkę nie jest w przypadku małego peptydu błędem zaokrąglenia, a dla długiego łańcucha ta różnica rośnie. Należy więc zawsze porównywać wartości tego samego rodzaju.
Wzór izotopowy
Przy wystarczającej rozdzielczości pik peptydu nie jest linią, lecz niewielkim skupiskiem. Wynika to z tego, że część cząsteczek zawiera cięższy izotop, przede wszystkim węgiel-13. Każdy dodatkowy izotop zwiększa masę cząsteczki o około jedną jednostkę masy, a na osi m/z ta jednostka jest dzielona przez ładunek. Odstęp między pikami w skupisku wynosi więc około 1 przy ładunku 1, około 0,5 przy ładunku 2 i około 0,33 przy ładunku 3. Pozwala to odczytać ładunek bezpośrednio ze wzoru.
Piki, które nie należą do peptydu
Nie każdy pik jest zanieczyszczeniem. Peptyd może też zamiast protonu przyłączyć jon sodu lub potasu. Na podstawie wartości z PubChem przesunięcie można dokładnie określić. Dla BPC-157:
- [M+Na]+ przy m/z 1441,69. Sód waży 22,990, czyli o 21,98 więcej niż proton.
- [M+K]+ przy m/z 1457,67. Potas waży 38,964, czyli o 37,96 więcej niż proton.
Inne przesunięcia wskazują na zmianę chemiczną w samym peptydzie. Manning i współpracownicy (Pharmaceutical Research, 2010) opisują reakcje, które za nimi stoją:
- Utlenienie: jeden dodatkowy atom tlenu. PubChem podaje dla atomu tlenu 15,995, a więc około +16 na każdy utleniony łańcuch boczny.
- Deamidacja: grupa amidowa (NH2) staje się grupą kwasową (OH). Ta różnica jest dokładnie różnicą między wodą (18,0106) a amoniakiem (17,0265) w PubChem: +0,98, w praktyce około +1.
- Utrata wody: -18,01, masa jednej cząsteczki wody według PubChem.
- Brakujący aminokwas: przesunięcie w dół o masę tej reszty, czyli masę wolnego aminokwasu pomniejszoną o jedną cząsteczkę wody. Dla proliny PubChem podaje 115,063; po odjęciu 18,011 daje to 97,05.
Skąd te produkty uboczne biorą się podczas syntezy, opisano w artykule Jak wytwarza się peptydy?; jak zapobiegać ich powstawaniu podczas przechowywania, opisano w artykule Przechowywanie peptydów w laboratorium.
Dwa przykłady z praktyki
Jedna nazwa, dwa związki. W tym katalogu TB-500 to fragment Ac-LKKTETQ o masie cząsteczkowej 889,0 według PubChem. Pełne białko tymozyna beta-4 ma w PubChem masę około 4963. Pomiar masy od razu rozstrzyga więc, który z tych dwóch związków znajduje się w fiolce, nawet gdy etykieta używa tej samej nazwy.
Z DAC lub bez DAC. CJC-1295 występuje w dwóch formach: z DAC, o masie cząsteczkowej 3647,2, oraz bez DAC, o masie 3367,9. Różnicy wynoszącej prawie 280 nie sposób przeoczyć w widmie.
W kombinacji każdy składnik powinien mieć własną masę; temu poświęcony jest artykuł Kombinacje peptydów: jak czytać etykietę i certyfikat COA.
Widmo masowe nigdy nie występuje na certyfikacie samodzielnie: czystość wynika z chromatogramu, a tożsamość z widma. Jak oba te elementy razem opisują partię, wyjaśniono w artykułach Czym jest certyfikat COA? i Co oznacza czystość 99%? Certyfikaty naszych partii znajdują się na stronie Wyniki analiz.
Źródła
Dostęp w listopadzie 2026 r.
- The Nobel Prize in Chemistry 2002 (Nobel Prize Outreach): John B. Fenn i Koichi Tanaka, z uzasadnieniem dotyczącym metod miękkiej jonizacji desorpcyjnej, oraz Kurt Wüthrich za magnetyczny rezonans jądrowy
- Hydrogen cation (PubChem), CID 1038: masa monoizotopowa 1,00783
- Sodium ion (PubChem), CID 923: 22,98977, oraz Potassium cation, CID 813: 38,96371
- Water (PubChem), CID 962: 18,01056, Ammonia, CID 222: 17,02655, oraz Atomic oxygen, CID 159832: 15,99491
- L-Proline (PubChem), CID 145742: 115,063
- BPC-157 (PubChem), CID 9941957: 1418,704 (monoizotopowa) i 1419,5 (średnia)
- TB-500 (Ac-LKKTETQ) (PubChem), CID 62707662: 889,0, oraz Thymosin Beta 4, CID 45382195: około 4963
- CJC-1295 (with DAC) (PubChem), CID 91971820: 3647,2, oraz CJC-1295 without DAC, CID 56841945: 3367,9
- Manning M.C. et al. (2010), Stability of protein pharmaceuticals: an update, Pharmaceutical Research (PubMed), PMID 20143256: utlenianie, deamidacja i hydroliza
Ten artykuł zawiera informacje ogólne na temat badań laboratoryjnych. Nie stanowi porady medycznej ani instrukcji użycia. Wszystkie produkty są przeznaczone wyłącznie do celów badawczych.
