Analyysitodistuksen identiteettinäyttö on massamittaus. Näin luet peptidisekvenssiä selittää, miten teoreettinen massa lasketaan sekvenssistä. Tämä artikkeli alkaa siitä, mihin se päättyy: itse spektristä.
Mitä x-akseli tarkoittaa
Massaspektrometri ei mittaa massaa vaan massan ja varauksen suhdetta: m/z. Siksi x-akselilla lukee m/z eikä dalton. Yhden varauksen hiukkasella nämä ovat lähes samat, kolmen varauksen hiukkasella ne eroavat kolminkertaisesti. Jokainen piikki herättää siis kaksi kysymystä: mikä massa ja mikä varaus?
Kaksi tapaa ionisoida
Molekyylin on ensin saatava varaus ja siirryttävä kaasufaasiin hajoamatta. Suurille biomolekyyleille tämä oli pitkään esteenä. Vuonna 2002 puolet kemian Nobel-palkinnosta myönnettiin John B. Fennille ja Koichi Tanakalle ”for their development of soft desorption ionisation methods for mass spectrometric analyses of biological macromolecules”; toinen puoli myönnettiin Kurt Wüthrichille ydinmagneettista resonanssia koskevasta työstä. Fenn työskenteli sähkösumutusionisaation (ESI) parissa, jossa liuos sumutetaan sähkökentässä; Tanaka osoitti, että myös laserdesorptio toimii, ja tätä lähestymistapaa käytetään MALDI-menetelmässä.
Se, kumman menetelmän todistus ilmoittaa, vaikuttaa spektrin ulkonäköön. Sähkösumutuksessa peptidi ottaa vastaan yhden tai useamman protonin, ja näet yleensä saman molekyylin piikkisarjan.
Varausten tikapuut
Protonoitu peptidi kirjoitetaan muodossa [M+zH]z+: neutraali massa M plus z protonia, jakautuneena z varaukselle. PubChem antaa protonin (vetykationin) monoisotooppiseksi massaksi 1,00783. Sen avulla voit laskea jokaisen varaustilan m/z-arvon. Otetaan esimerkiksi BPC-157, jonka monoisotooppinen massa on PubChemin mukaan 1 418,704:
| Ioni | Laskutoimitus | m/z |
|---|---|---|
| [M+H]+ | (1 418,704 + 1,008) / 1 | 1 419,71 |
| [M+2H]2+ | (1 418,704 + 2 × 1,008) / 2 | 710,36 |
| [M+3H]3+ | (1 418,704 + 3 × 1,008) / 3 | 473,91 |
Lasku toimii yhtä hyvin myös toisin päin: piikistä kohdassa m/z 710,36 varauksella 2 seuraa, että M = 2 × 710,36 – 2 × 1,008 = 1 418,70. Laskemista m/z-arvosta takaisin neutraaliin massaan kutsutaan dekonvoluutioksi. Ohjelmisto tekee sen, mutta kahdella piikillä ja laskimella pääsee samaan.
Monoisotooppinen vai keskimääräinen
PubChem antaa kullekin yhdisteelle kaksi massaa. BPC-157:lle ne ovat 1 418,70 monoisotooppisena ja 1 419,5 keskimääräisenä. Monoisotooppinen massa on sen molekyylin massa, jonka jokainen atomi on yleisintä isotooppia; keskimääräinen massa ottaa huomioon kaikkien isotooppien luonnollisen jakauman ja on siksi hieman suurempi.
Todistuksessa pitäisi ilmoittaa, kumpi näistä on kyseessä. Lähes yhden yksikön ero ei pienellä peptidillä ole pyöristysvirhe, ja pitkällä ketjulla ero kasvaa. Vertaa siis aina samanlaisia arvoja keskenään.
Isotooppikuvio
Riittävällä erotuskyvyllä peptidipiikki ei ole viiva vaan pieni rypäs. Tämä johtuu siitä, että osa molekyyleistä sisältää raskaamman isotoopin, ennen kaikkea hiili-13:n. Jokainen ylimääräinen isotooppi tekee molekyylistä noin yhden massayksikön raskaamman, ja m/z-akselilla tämä yksikkö jaetaan varauksella. Rypään piikkien väli on siis noin 1 varauksella 1, noin 0,5 varauksella 2 ja noin 0,33 varauksella 3. Näin varauksen voi lukea suoraan kuviosta.
Piikit, jotka eivät kuulu peptidiin
Kaikki piikit eivät ole epäpuhtauksia. Peptidi voi myös ottaa vastaan natrium- tai kaliumionin protonin sijaan. PubChemin arvoilla siirtymä voidaan nimetä tarkasti. BPC-157:lle:
- [M+Na]+ kohdassa m/z 1 441,69. Natrium painaa 22,990, eli 21,98 enemmän kuin protoni.
- [M+K]+ kohdassa m/z 1 457,67. Kalium painaa 38,964, eli 37,96 enemmän kuin protoni.
Muut siirtymät viittaavat kemialliseen muutokseen itse peptidissä. Manning ja kollegat (Pharmaceutical Research, 2010) kuvaavat niiden taustalla olevat reaktiot:
- Hapettuminen: yksi ylimääräinen happiatomi. PubChem antaa happiatomin massaksi 15,995, eli noin +16 kutakin hapettunutta sivuketjua kohden.
- Deamidaatio: amidiryhmästä (NH2) tulee happoryhmä (OH). Ero on täsmälleen veden (18,0106) ja ammoniakin (17,0265) ero PubChemissa: +0,98, käytännössä noin +1.
- Veden menetys: -18,01, yhden vesimolekyylin massa PubChemin mukaan.
- Puuttuva aminohappo: siirtymä alaspäin kyseisen tähteen massan verran, joka on vapaan aminohapon massa miinus yksi vesimolekyyli. Proliinille PubChem antaa 115,063; siitä miinus 18,011 on 97,05.
Mistä nämä sivutuotteet syntyvät synteesin aikana, kerrotaan artikkelissa Miten peptidejä valmistetaan?; miten niiden muodostuminen säilytyksen aikana estetään, kerrotaan artikkelissa Peptidien säilytys laboratoriossa.
Kaksi esimerkkiä käytännöstä
Yksi nimi, kaksi yhdistettä. Tässä valikoimassa TB-500 on fragmentti Ac-LKKTETQ, jonka molekyylipaino on PubChemin mukaan 889,0. Koko proteiinin tymosiini beeta-4:n paino on PubChemissa noin 4 963. Massamittaus ratkaisee siis heti, kumpi näistä on injektiopullossa, vaikka etiketissä käytettäisiin samaa nimeä.
DAC:n kanssa tai ilman. CJC-1295 on olemassa kahdessa muodossa: DAC:n kanssa, molekyylipainoltaan 3 647,2, ja ilman DAC:tä, 3 367,9. Lähes 280:n eroa ei spektrissä voi olla huomaamatta.
Yhdistelmässä jokaisella komponentilla pitäisi olla oma massansa; siitä kerrotaan artikkelissa Peptidiyhdistelmät: etiketin ja analyysitodistuksen lukeminen.
Massaspektri ei koskaan ole todistuksessa yksin: puhtaus saadaan kromatogrammista ja identiteetti spektristä. Miten nämä kaksi yhdessä kuvaavat erää, selitetään artikkeleissa Mikä on COA? ja Mitä 99 %:n puhtaus tarkoittaa? Eriemme todistukset ovat Analyysitulokset-sivulla.
Lähteet
Luettu marraskuussa 2026.
- The Nobel Prize in Chemistry 2002 (Nobel Prize Outreach): John B. Fenn ja Koichi Tanaka, perusteluna pehmeät desorptioionisaatiomenetelmät, sekä Kurt Wüthrich ydinmagneettisesta resonanssista
- Hydrogen cation (PubChem), CID 1038: monoisotooppinen massa 1,00783
- Sodium ion (PubChem), CID 923: 22,98977, ja Potassium cation, CID 813: 38,96371
- Water (PubChem), CID 962: 18,01056, Ammonia, CID 222: 17,02655, ja Atomic oxygen, CID 159832: 15,99491
- L-Proline (PubChem), CID 145742: 115,063
- BPC-157 (PubChem), CID 9941957: 1 418,704 monoisotooppinen ja 1 419,5 keskimääräinen
- TB-500 (Ac-LKKTETQ) (PubChem), CID 62707662: 889,0, ja Thymosin Beta 4, CID 45382195: noin 4 963
- CJC-1295 (with DAC) (PubChem), CID 91971820: 3 647,2, ja CJC-1295 without DAC, CID 56841945: 3 367,9
- Manning M.C. et al. (2010), Stability of protein pharmaceuticals: an update, Pharmaceutical Research (PubMed), PMID 20143256: hapettuminen, deamidaatio ja hydrolyysi
Tämä artikkeli on taustatietoa laboratoriotutkimuksesta. Se ei ole lääketieteellistä neuvontaa eikä käyttöohje. Kaikki tuotteet on tarkoitettu ainoastaan tutkimuskäyttöön.
