Identitetsbeviset på ett analyscertifikat är en massmätning. Så läser du en peptidsekvens förklarar hur du beräknar den teoretiska massan utifrån sekvensen. Den här artikeln börjar där den slutar: vid själva spektrumet.
Vad x-axeln betyder
En masspektrometer mäter inte massa utan förhållandet mellan massa och laddning: m/z. Därför står det m/z på x-axeln och inte dalton. För en partikel med en laddning är de två nästan lika; för en partikel med tre laddningar skiljer de sig åt med en faktor tre. Varje topp väcker alltså två frågor: vilken massa och vilken laddning?
Två sätt att jonisera
En molekyl måste först ta upp en laddning och nå gasfasen utan att falla sönder. För stora biomolekyler var det länge hindret. År 2002 gick halva Nobelpriset i kemi till John B. Fenn och Koichi Tanaka ”for their development of soft desorption ionisation methods for mass spectrometric analyses of biological macromolecules”; den andra halvan gick till Kurt Wüthrich för arbete med kärnmagnetisk resonans. Fenn arbetade med elektrosprayjonisering (ESI), där en lösning sprayas i ett elektriskt fält; Tanaka visade att även laserdesorption fungerar, det tillvägagångssätt som används i MALDI.
Vilken av de två metoderna ett certifikat anger påverkar hur spektrumet ser ut. Med elektrospray tar en peptid upp en eller flera protoner, och du ser oftast en serie toppar från samma molekyl.
Stegar av laddningar
En protonerad peptid skrivs som [M+zH]z+: den neutrala massan M plus z protoner, fördelade på z laddningar. PubChem anger för protonen (vätekatjonen) en monoisotopisk massa på 1,00783. Med den kan du beräkna m/z för varje laddningstillstånd. Ta BPC-157, med en monoisotopisk massa på 1 418,704 enligt PubChem:
| Jon | Beräkning | m/z |
|---|---|---|
| [M+H]+ | (1 418,704 + 1,008) / 1 | 1 419,71 |
| [M+2H]2+ | (1 418,704 + 2 × 1,008) / 2 | 710,36 |
| [M+3H]3+ | (1 418,704 + 3 × 1,008) / 3 | 473,91 |
Det fungerar lika bra baklänges: av en topp vid m/z 710,36 med laddningen 2 följer att M = 2 × 710,36 − 2 × 1,008 = 1 418,70. Att räkna tillbaka från m/z till den neutrala massan kallas dekonvolution. Programvara gör det, men två toppar och en miniräknare räcker också.
Monoisotopisk eller genomsnittlig
PubChem anger två massor per förening. För BPC-157 är det 1 418,70 monoisotopisk och 1 419,5 genomsnittlig. Den monoisotopiska massan gäller molekylen där varje atom är den vanligaste isotopen; den genomsnittliga massan tar hänsyn till den naturliga fördelningen av alla isotoper och är därför något högre.
Vilken av de två ett certifikat anger ska framgå av det. En skillnad på nästan en enhet är inget avrundningsfel för en liten peptid, och för en lång kedja blir skillnaden större. Jämför därför alltid lika med lika.
Isotopmönster
Vid tillräcklig upplösning är en peptidtopp inte en linje utan ett litet kluster. Det beror på att en del av molekylerna innehåller en tyngre isotop, framför allt kol-13. Varje extra isotop gör molekylen ungefär en massenhet tyngre, och på m/z-axeln delas den enheten med laddningen. Avståndet mellan topparna i klustret är alltså ca 1 vid laddning 1, ca 0,5 vid laddning 2 och ca 0,33 vid laddning 3. Därmed kan du läsa av laddningen direkt i mönstret.
Toppar som inte hör till peptiden
Inte varje topp är en förorening. En peptid kan också ta upp en natrium- eller kaliumjon i stället för en proton. Med värdena från PubChem kan förskjutningen anges exakt. För BPC-157:
- [M+Na]+ vid m/z 1 441,69. Natrium väger 22,990, alltså 21,98 mer än protonen.
- [M+K]+ vid m/z 1 457,67. Kalium väger 38,964, alltså 37,96 mer än protonen.
Andra förskjutningar tyder på en kemisk förändring i själva peptiden. Manning och kollegor (Pharmaceutical Research, 2010) beskriver reaktionerna bakom dem:
- Oxidation: en extra syreatom. PubChem anger syreatomen till 15,995, alltså ca +16 per oxiderad sidokedja.
- Deamidering: en amidgrupp (NH2) blir en syragrupp (OH). Den skillnaden är exakt skillnaden mellan vatten (18,0106) och ammoniak (17,0265) i PubChem: +0,98, i praktiken ca +1.
- Vattenförlust: −18,01, massan av en vattenmolekyl enligt PubChem.
- En saknad aminosyra: en förskjutning nedåt med massan av den resten, som är massan av den fria aminosyran minus en vattenmolekyl. För prolin anger PubChem 115,063; minus 18,011 blir det 97,05.
Var dessa biprodukter uppstår under syntesen beskrivs i Hur framställs peptider?; hur du förhindrar att de bildas vid förvaring finns i Förvaring av peptider i laboratoriet.
Två exempel från praktiken
Ett namn, två föreningar. I den här katalogen är TB-500 fragmentet Ac-LKKTETQ med en molekylvikt på 889,0 enligt PubChem. Det kompletta proteinet tymosin beta-4 har i PubChem en vikt på ca 4 963. En massmätning avgör alltså direkt vilken av de två som finns i flaskan, även när etiketten använder samma namn.
Med eller utan DAC. CJC-1295 finns i två former: med DAC, med en molekylvikt på 3 647,2, och utan DAC, med 3 367,9. En skillnad på nästan 280 går inte att missa i ett spektrum.
I en blandning ska varje komponent ha sin egen massa; det är ämnet för Peptidkombinationer i forskningen.
Ett masspektrum står aldrig ensamt på ett certifikat: renheten kommer från kromatogrammet och identiteten från spektrumet. Hur de två tillsammans beskriver en batch förklaras i Vad är ett COA? och Vad betyder 99 % renhet? Certifikaten för våra batcher finns under Analysresultat.
Källor
Hämtade i november 2026.
- The Nobel Prize in Chemistry 2002 (Nobel Prize Outreach): John B. Fenn och Koichi Tanaka, med motiveringen om mjuka desorptionsjoniseringsmetoder, och Kurt Wüthrich för kärnmagnetisk resonans
- Hydrogen cation (PubChem), CID 1038: monoisotopisk massa 1,00783
- Sodium ion (PubChem), CID 923: 22,98977, och Potassium cation, CID 813: 38,96371
- Water (PubChem), CID 962: 18,01056, Ammonia, CID 222: 17,02655, och Atomic oxygen, CID 159832: 15,99491
- L-Proline (PubChem), CID 145742: 115,063
- BPC-157 (PubChem), CID 9941957: 1 418,704 monoisotopisk och 1 419,5 genomsnittlig
- TB-500 (Ac-LKKTETQ) (PubChem), CID 62707662: 889,0, och Thymosin Beta 4, CID 45382195: ca 4 963
- CJC-1295 (with DAC) (PubChem), CID 91971820: 3 647,2, och CJC-1295 without DAC, CID 56841945: 3 367,9
- Manning M.C. et al. (2010), Stability of protein pharmaceuticals: an update, Pharmaceutical Research (PubMed), PMID 20143256: oxidation, deamidering och hydrolys
Den här artikeln innehåller bakgrundsinformation om laboratorieforskning. Den är varken medicinsk rådgivning eller bruksanvisning. Alla produkter är endast avsedda för forskningsändamål.
