La prova dell’identità su un certificato di analisi è una misura di massa. Come leggere una sequenza peptidica spiega come calcolare la massa teorica dalla sequenza. Questo articolo comincia dove finisce quello: dallo spettro stesso.
Che cosa indica l’asse x
Uno spettrometro di massa non misura la massa, ma il rapporto tra massa e carica: m/z. Per questo sull’asse x si legge m/z e non dalton. Per una particella con una sola carica i due valori sono quasi uguali; per una particella con tre cariche differiscono di un fattore tre. Ogni picco pone quindi due domande: quale massa, e quale carica?
Due modi di ionizzare
Una molecola deve prima acquisire una carica e passare in fase gassosa senza frammentarsi. Per le grandi biomolecole questo è stato a lungo l’ostacolo. Nel 2002 metà del premio Nobel per la chimica è andata a John B. Fenn e Koichi Tanaka «for their development of soft desorption ionisation methods for mass spectrometric analyses of biological macromolecules»; l’altra metà è andata a Kurt Wüthrich per i lavori sulla risonanza magnetica nucleare. Fenn lavorava con la ionizzazione elettrospray (ESI), in cui una soluzione viene nebulizzata in un campo elettrico; Tanaka dimostrò che funziona anche il desorbimento laser, l’approccio usato nella MALDI.
Quale dei due metodi riporta un certificato determina l’aspetto dello spettro. Con l’elettrospray un peptide acquista uno o più protoni e di norma si vede una serie di picchi della stessa molecola.
Scale di cariche
Un peptide protonato si scrive [M+zH]z+: la massa neutra M più z protoni, distribuiti su z cariche. PubChem attribuisce al protone (il catione idrogeno) una massa monoisotopica di 1,00783. Con questo valore si può calcolare il rapporto m/z di ogni stato di carica. Prendiamo BPC-157, con una massa monoisotopica di 1418,704 secondo PubChem:
| Ione | Calcolo | m/z |
|---|---|---|
| [M+H]+ | (1418,704 + 1,008) / 1 | 1419,71 |
| [M+2H]2+ | (1418,704 + 2 × 1,008) / 2 | 710,36 |
| [M+3H]3+ | (1418,704 + 3 × 1,008) / 3 | 473,91 |
Funziona altrettanto bene al contrario: da un picco a m/z 710,36 con carica 2 si ricava M = 2 × 710,36 – 2 × 1,008 = 1418,70. Questo calcolo a ritroso da m/z alla massa neutra si chiama deconvoluzione. Lo fa il software, ma ci si arriva anche con due picchi e una calcolatrice.
Monoisotopica o media
PubChem fornisce due masse per ogni composto. Per BPC-157 sono 1418,70 come massa monoisotopica e 1419,5 come massa media. La massa monoisotopica è quella della molecola in cui ogni atomo è l’isotopo più comune; la massa media tiene conto della distribuzione naturale di tutti gli isotopi ed è quindi leggermente più alta.
Quale delle due riporta un certificato deve essere indicato sul certificato stesso. Per un piccolo peptide una differenza di quasi un’unità non è un errore di arrotondamento, e per una catena lunga lo scarto aumenta. Confronti quindi sempre masse dello stesso tipo.
Profilo isotopico
Con una risoluzione sufficiente, il picco di un peptide non è una linea ma un piccolo gruppo di picchi. Questo perché una parte delle molecole contiene un isotopo più pesante, soprattutto il carbonio-13. Ogni isotopo in più rende la molecola più pesante di circa un’unità di massa, e sull’asse m/z questa unità viene divisa per la carica. La distanza tra i picchi del gruppo è quindi di circa 1 con carica 1, di circa 0,5 con carica 2 e di circa 0,33 con carica 3. In questo modo la carica si legge direttamente dal profilo.
Picchi che non appartengono al peptide
Non tutti i picchi sono impurezze. Un peptide può anche legare uno ione sodio o potassio anziché un protone. Con i valori di PubChem lo spostamento si può indicare con precisione. Per BPC-157:
- [M+Na]+ a m/z 1441,69. Il sodio pesa 22,990, quindi 21,98 più del protone.
- [M+K]+ a m/z 1457,67. Il potassio pesa 38,964, quindi 37,96 più del protone.
Altri spostamenti indicano una modifica chimica del peptide stesso. Manning e colleghi (Pharmaceutical Research, 2010) descrivono le reazioni che ne sono all’origine:
- Ossidazione: un atomo di ossigeno in più. PubChem indica per l’atomo di ossigeno 15,995, quindi circa +16 per ogni catena laterale ossidata.
- Deamidazione: un gruppo ammidico (NH2) diventa un gruppo acido (OH). Questa differenza corrisponde esattamente a quella tra acqua (18,0106) e ammoniaca (17,0265) in PubChem: +0,98, in pratica circa +1.
- Perdita d’acqua: -18,01, la massa di una molecola d’acqua secondo PubChem.
- Un amminoacido mancante: uno spostamento verso il basso pari alla massa di quel residuo, cioè la massa dell’amminoacido libero meno una molecola d’acqua. Per la prolina PubChem indica 115,063; meno 18,011 fa 97,05.
Da dove provengono questi sottoprodotti durante la sintesi è spiegato in Come si producono i peptidi?; come evitare che si formino durante la conservazione, in Conservare i peptidi in laboratorio.
Due esempi pratici
Un nome, due composti. In questo catalogo TB-500 è il frammento Ac-LKKTETQ, con un peso molecolare di 889,0 secondo PubChem. La proteina completa, la timosina β4, ha in PubChem un peso di circa 4963. Una misura di massa stabilisce quindi subito quale dei due si trova nel flaconcino, anche quando l’etichetta usa lo stesso nome.
Con o senza DAC. CJC-1295 esiste in due forme: con DAC, con un peso molecolare di 3647,2, e senza DAC, con 3367,9. In uno spettro una differenza di quasi 280 non può sfuggire.
In una combinazione ogni componente deve avere la propria massa; è l’argomento di Combinazioni di peptidi: leggere l’etichetta e il COA.
Su un certificato uno spettro di massa non compare mai da solo: la purezza deriva dal cromatogramma e l’identità dallo spettro. Come i due insieme descrivono un lotto è spiegato in Che cos’è un COA? e Che cosa significa una purezza del 99%? I certificati dei nostri lotti si trovano nella pagina Risultati di laboratorio.
Fonti
Consultati a novembre 2026.
- The Nobel Prize in Chemistry 2002 (Nobel Prize Outreach): John B. Fenn e Koichi Tanaka, con la motivazione sui metodi di ionizzazione per desorbimento soft, e Kurt Wüthrich per la risonanza magnetica nucleare
- Hydrogen cation (PubChem), CID 1038: massa monoisotopica 1,00783
- Sodium ion (PubChem), CID 923: 22,98977, e Potassium cation, CID 813: 38,96371
- Water (PubChem), CID 962: 18,01056, Ammonia, CID 222: 17,02655, e Atomic oxygen, CID 159832: 15,99491
- L-Proline (PubChem), CID 145742: 115,063
- BPC-157 (PubChem), CID 9941957: 1418,704 monoisotopica e 1419,5 media
- TB-500 (Ac-LKKTETQ) (PubChem), CID 62707662: 889,0, e Thymosin Beta 4, CID 45382195: circa 4963
- CJC-1295 (con DAC) (PubChem), CID 91971820: 3647,2, e CJC-1295 senza DAC, CID 56841945: 3367,9
- Manning M.C. et al. (2010), Stability of protein pharmaceuticals: an update, Pharmaceutical Research (PubMed), PMID 20143256: ossidazione, deamidazione e idrolisi
Questo articolo fornisce informazioni di contesto sulla ricerca di laboratorio. Non costituisce una consulenza medica né istruzioni per l’uso. Tutti i prodotti sono destinati esclusivamente alla ricerca.
