Η απόδειξη ταυτότητας σε ένα πιστοποιητικό ανάλυσης είναι μια μέτρηση μάζας. Το άρθρο Πώς να διαβάσετε μια πεπτιδική αλληλουχία εξηγεί πώς υπολογίζεται η θεωρητική μάζα από την αλληλουχία. Το παρόν άρθρο ξεκινά εκεί όπου σταματά εκείνο: στο ίδιο το φάσμα.
Τι σημαίνει ο άξονας x
Ένα φασματόμετρο μάζας δεν μετρά μάζα αλλά τον λόγο μάζας προς φορτίο: m/z. Γι’ αυτό ο άξονας x γράφει m/z και όχι dalton. Για ένα σωματίδιο με ένα φορτίο τα δύο είναι σχεδόν ίδια, για ένα σωματίδιο με τρία φορτία διαφέρουν κατά παράγοντα τρία. Κάθε κορυφή θέτει επομένως δύο ερωτήματα: ποια μάζα και ποιο φορτίο;
Δύο τρόποι ιονισμού
Ένα μόριο πρέπει πρώτα να αποκτήσει φορτίο και να περάσει στην αέρια φάση χωρίς να διασπαστεί. Για τα μεγάλα βιομόρια αυτό ήταν για πολύ καιρό το εμπόδιο. Το 2002 το ήμισυ του βραβείου Νόμπελ Χημείας απονεμήθηκε στους John B. Fenn και Koichi Tanaka «for their development of soft desorption ionisation methods for mass spectrometric analyses of biological macromolecules»· το άλλο ήμισυ απονεμήθηκε στον Kurt Wüthrich για εργασίες με τον πυρηνικό μαγνητικό συντονισμό. Ο Fenn εργάστηκε με τον ιονισμό ηλεκτροψεκασμού (ESI), κατά τον οποίο ένα διάλυμα ψεκάζεται σε ηλεκτρικό πεδίο· ο Tanaka έδειξε ότι λειτουργεί και η εκρόφηση με λέιζερ, η προσέγγιση που χρησιμοποιείται στο MALDI.
Ποια από τις δύο μεθόδους αναφέρει ένα πιστοποιητικό καθορίζει την εμφάνιση του φάσματος. Με τον ηλεκτροψεκασμό, ένα πεπτίδιο προσλαμβάνει ένα ή περισσότερα πρωτόνια και συνήθως βλέπετε μια σειρά κορυφών από το ίδιο μόριο.
Κλίμακες φορτίων
Ένα πρωτονιωμένο πεπτίδιο γράφεται ως [M+zH]z+: η ουδέτερη μάζα M συν z πρωτόνια, κατανεμημένα σε z φορτία. Το PubChem δίνει για το πρωτόνιο (το κατιόν υδρογόνου) μονοϊσοτοπική μάζα 1,00783. Με αυτήν μπορείτε να υπολογίσετε το m/z κάθε κατάστασης φορτίου. Πάρτε το BPC-157, με μονοϊσοτοπική μάζα 1.418,704 σύμφωνα με το PubChem:
| Ιόν | Υπολογισμός | m/z |
|---|---|---|
| [M+H]+ | (1.418,704 + 1,008) / 1 | 1.419,71 |
| [M+2H]2+ | (1.418,704 + 2 × 1,008) / 2 | 710,36 |
| [M+3H]3+ | (1.418,704 + 3 × 1,008) / 3 | 473,91 |
Λειτουργεί εξίσου καλά και αντίστροφα: από μια κορυφή στο m/z 710,36 με φορτίο 2 προκύπτει ότι M = 2 × 710,36 – 2 × 1,008 = 1.418,70. Η αναγωγή από το m/z στην ουδέτερη μάζα ονομάζεται αποσυνέλιξη. Την κάνει το λογισμικό, αλλά αρκούν και δύο κορυφές και μια αριθμομηχανή.
Μονοϊσοτοπική ή μέση
Το PubChem δίνει δύο μάζες για κάθε ένωση. Για το BPC-157 αυτές είναι 1.418,70 μονοϊσοτοπική και 1.419,5 μέση. Η μονοϊσοτοπική μάζα αντιστοιχεί στο μόριο στο οποίο κάθε άτομο είναι το συνηθέστερο ισότοπο· η μέση μάζα λαμβάνει υπόψη τη φυσική κατανομή όλων των ισοτόπων και είναι επομένως ελαφρώς υψηλότερη.
Ποια από τις δύο αναφέρει ένα πιστοποιητικό θα πρέπει να δηλώνεται σε αυτό. Μια διαφορά σχεδόν μίας μονάδας δεν είναι σφάλμα στρογγυλοποίησης για ένα μικρό πεπτίδιο, και για μια μακριά αλυσίδα η απόκλιση μεγαλώνει. Συγκρίνετε επομένως πάντα όμοια με όμοια.
Ισοτοπικό πρότυπο
Σε επαρκή διακριτική ικανότητα, η κορυφή ενός πεπτιδίου δεν είναι μια γραμμή αλλά μια μικρή ομάδα. Αυτό οφείλεται στο ότι ένα μέρος των μορίων περιέχει ένα βαρύτερο ισότοπο, κυρίως άνθρακα-13. Κάθε επιπλέον ισότοπο κάνει το μόριο περίπου μία μονάδα μάζας βαρύτερο, και στον άξονα m/z αυτή η μονάδα διαιρείται με το φορτίο. Η απόσταση μεταξύ των κορυφών της ομάδας είναι επομένως περίπου 1 σε φορτίο 1, περίπου 0,5 σε φορτίο 2 και περίπου 0,33 σε φορτίο 3. Έτσι μπορείτε να διαβάσετε το φορτίο απευθείας από το πρότυπο.
Κορυφές που δεν ανήκουν στο πεπτίδιο
Δεν είναι κάθε κορυφή πρόσμειξη. Ένα πεπτίδιο μπορεί επίσης να προσλάβει ένα ιόν νατρίου ή καλίου αντί για πρωτόνιο. Με τις τιμές του PubChem η μετατόπιση μπορεί να προσδιοριστεί ακριβώς. Για το BPC-157:
- [M+Na]+ στο m/z 1.441,69. Το νάτριο ζυγίζει 22,990, δηλαδή 21,98 περισσότερο από το πρωτόνιο.
- [M+K]+ στο m/z 1.457,67. Το κάλιο ζυγίζει 38,964, δηλαδή 37,96 περισσότερο από το πρωτόνιο.
Άλλες μετατοπίσεις υποδηλώνουν χημική μεταβολή στο ίδιο το πεπτίδιο. Ο Manning και οι συνεργάτες του (Pharmaceutical Research, 2010) περιγράφουν τις αντιδράσεις που βρίσκονται πίσω από αυτές:
- Οξείδωση: ένα επιπλέον άτομο οξυγόνου. Το PubChem δίνει για το άτομο οξυγόνου 15,995, δηλαδή περίπου +16 ανά οξειδωμένη πλευρική αλυσίδα.
- Απαμίδωση: μια αμιδική ομάδα (NH2) γίνεται όξινη ομάδα (OH). Η διαφορά αυτή είναι ακριβώς η διαφορά μεταξύ νερού (18,0106) και αμμωνίας (17,0265) στο PubChem: +0,98, στην πράξη περίπου +1.
- Απώλεια νερού: -18,01, η μάζα ενός μορίου νερού σύμφωνα με το PubChem.
- Ένα αμινοξύ που λείπει: μετατόπιση προς τα κάτω κατά τη μάζα του καταλοίπου αυτού, δηλαδή τη μάζα του ελεύθερου αμινοξέος μείον ένα μόριο νερού. Για την προλίνη το PubChem δίνει 115,063· μείον 18,011, αυτό κάνει 97,05.
Από πού προέρχονται αυτά τα παραπροϊόντα κατά τη σύνθεση εξηγείται στο Πώς παρασκευάζονται τα πεπτίδια;· πώς αποτρέπεται ο σχηματισμός τους κατά την αποθήκευση εξηγείται στο Φύλαξη πεπτιδίων στο εργαστήριο.
Δύο παραδείγματα από την πράξη
Μία ονομασία, δύο ενώσεις. Σε αυτόν τον κατάλογο, το TB-500 είναι το θραύσμα Ac-LKKTETQ με μοριακό βάρος 889,0 σύμφωνα με το PubChem. Η πλήρης πρωτεΐνη θυμοσίνη β4 έχει βάρος περίπου 4.963 στο PubChem. Μια μέτρηση μάζας κρίνει επομένως αμέσως ποια από τις δύο βρίσκεται στο φιαλίδιο, ακόμη και όταν η ετικέτα χρησιμοποιεί την ίδια ονομασία.
Με ή χωρίς DAC. Το CJC-1295 υπάρχει σε δύο μορφές: με DAC, με μοριακό βάρος 3.647,2, και χωρίς DAC, με 3.367,9. Μια διαφορά σχεδόν 280 είναι αδύνατον να περάσει απαρατήρητη σε ένα φάσμα.
Σε ένα μείγμα, κάθε συστατικό θα πρέπει να έχει τη δική του μάζα· αυτό είναι το θέμα του άρθρου Συνδυασμοί πεπτιδίων.
Ένα φάσμα μάζας δεν στέκεται ποτέ μόνο του σε ένα πιστοποιητικό: η καθαρότητα προκύπτει από το χρωματογράφημα και η ταυτότητα από το φάσμα. Πώς τα δύο μαζί περιγράφουν μια παρτίδα εξηγείται στα άρθρα Τι είναι το COA; και Τι σημαίνει καθαρότητα 99%; Τα πιστοποιητικά των παρτίδων μας βρίσκονται στη σελίδα Εργαστηριακά αποτελέσματα.
Πηγές
Πρόσβαση τον Νοέμβριο του 2026.
- The Nobel Prize in Chemistry 2002 (Nobel Prize Outreach): John B. Fenn και Koichi Tanaka, με την αιτιολόγηση για τις μεθόδους ήπιου ιοντισμού με εκρόφηση, και Kurt Wüthrich για τον πυρηνικό μαγνητικό συντονισμό
- Hydrogen cation (PubChem), CID 1038: μονοϊσοτοπική μάζα 1,00783
- Sodium ion (PubChem), CID 923: 22,98977, και Potassium cation, CID 813: 38,96371
- Water (PubChem), CID 962: 18,01056, Ammonia, CID 222: 17,02655, και Atomic oxygen, CID 159832: 15,99491
- L-Proline (PubChem), CID 145742: 115.063
- BPC-157 (PubChem), CID 9941957: 1.418,704 μονοϊσοτοπική και 1.419,5 μέση
- TB-500 (Ac-LKKTETQ) (PubChem), CID 62707662: 889,0, και Thymosin Beta 4, CID 45382195: περίπου 4.963
- CJC-1295 (with DAC) (PubChem), CID 91971820: 3.647,2, και CJC-1295 without DAC, CID 56841945: 3.367,9
- Manning M.C. et al. (2010), Stability of protein pharmaceuticals: an update, Pharmaceutical Research (PubMed), PMID 20143256: οξείδωση, απαμίδωση και υδρόλυση
Το άρθρο αυτό παρέχει πληροφορίες υποβάθρου για την εργαστηριακή έρευνα. Δεν αποτελεί ιατρική συμβουλή ούτε οδηγίες χρήσης. Όλα τα προϊόντα προορίζονται αποκλειστικά για ερευνητική χρήση.
