Dovada identității de pe un certificat de analiză este o măsurare de masă. Cum se citește o secvență peptidică explică cum calculați masa teoretică pornind de la secvență. Acest articol începe acolo unde se oprește acela: la spectrul propriu-zis.
Ce înseamnă axa x
Un spectrometru de masă nu măsoară masa, ci raportul dintre masă și sarcină: m/z. De aceea pe axa x scrie m/z și nu dalton. Pentru o particulă cu o singură sarcină, cele două sunt aproape identice; pentru o particulă cu trei sarcini, diferă de trei ori. Așadar, fiecare pic ridică două întrebări: ce masă și ce sarcină?
Două moduri de ionizare
O moleculă trebuie mai întâi să preia o sarcină și să ajungă în faza gazoasă fără să se descompună. Pentru biomoleculele mari, acesta a fost mult timp obstacolul. În 2002, jumătate din Premiul Nobel pentru Chimie le-a revenit lui John B. Fenn și Koichi Tanaka „for their development of soft desorption ionisation methods for mass spectrometric analyses of biological macromolecules”; cealaltă jumătate i-a revenit lui Kurt Wüthrich pentru lucrări cu rezonanța magnetică nucleară. Fenn a lucrat cu ionizarea prin electropulverizare (ESI), în care o soluție este pulverizată într-un câmp electric; Tanaka a arătat că funcționează și desorbția laser, abordarea folosită în MALDI.
Metoda pe care o indică un certificat determină aspectul spectrului. La electropulverizare, o peptidă preia unul sau mai mulți protoni și vedeți de obicei o serie de picuri ale aceleiași molecule.
Scări de sarcini
O peptidă protonată se scrie [M+zH]z+: masa neutră M plus z protoni, repartizați pe z sarcini. PubChem indică pentru proton (cationul de hidrogen) o masă monoizotopică de 1,00783. Cu aceasta puteți calcula m/z pentru fiecare stare de sarcină. Luați BPC-157, cu o masă monoizotopică de 1418,704 conform PubChem:
| Ion | Calcul | m/z |
|---|---|---|
| [M+H]+ | (1418,704 + 1,008) / 1 | 1419,71 |
| [M+2H]2+ | (1418,704 + 2 × 1,008) / 2 | 710,36 |
| [M+3H]3+ | (1418,704 + 3 × 1,008) / 3 | 473,91 |
Funcționează la fel de bine și invers: dintr-un pic la m/z 710,36 cu sarcina 2 rezultă M = 2 × 710,36 – 2 × 1,008 = 1418,70. Calculul invers, de la m/z la masa neutră, se numește deconvoluție. Îl face un software, dar ajungeți la rezultat și cu două picuri și un calculator.
Monoizotopică sau medie
PubChem indică două mase pentru fiecare compus. Pentru BPC-157, acestea sunt 1418,70 monoizotopică și 1419,5 medie. Masa monoizotopică aparține moleculei în care fiecare atom este izotopul cel mai frecvent; masa medie ține seama de distribuția naturală a tuturor izotopilor și este, prin urmare, puțin mai mare.
Care dintre cele două este raportată ar trebui să fie menționat pe certificat. O diferență de aproape o unitate nu este o eroare de rotunjire pentru o peptidă mică, iar pentru un lanț lung diferența crește. Așadar, comparați întotdeauna mărimi de același tip.
Modelul izotopic
La o rezoluție suficientă, un pic al unei peptide nu este o linie, ci un mic grup de picuri. Motivul este că o parte dintre molecule conțin un izotop mai greu, mai ales carbon-13. Fiecare izotop suplimentar face molecula cu aproximativ o unitate de masă mai grea, iar pe axa m/z această unitate se împarte la sarcină. Așadar, distanța dintre picurile din grup este de aproximativ 1 la sarcina 1, aproximativ 0,5 la sarcina 2 și aproximativ 0,33 la sarcina 3. Astfel puteți citi sarcina direct din model.
Picuri care nu aparțin peptidei
Nu orice pic este o impuritate. O peptidă poate prelua și un ion de sodiu sau de potasiu în locul unui proton. Cu valorile din PubChem, deplasarea poate fi numită exact. Pentru BPC-157:
- [M+Na]+ la m/z 1441,69. Sodiul cântărește 22,990, deci cu 21,98 mai mult decât protonul.
- [M+K]+ la m/z 1457,67. Potasiul cântărește 38,964, deci cu 37,96 mai mult decât protonul.
Alte deplasări indică o modificare chimică a peptidei înseși. Manning și colaboratorii (Pharmaceutical Research, 2010) descriu reacțiile care stau la baza lor:
- Oxidare: un atom de oxigen în plus. PubChem indică atomul de oxigen ca 15,995, deci aproximativ +16 pentru fiecare catenă laterală oxidată.
- Dezamidare: o grupare amidă (NH2) devine o grupare acid (OH). Această diferență este exact diferența dintre apă (18,0106) și amoniac (17,0265) în PubChem: +0,98, în practică aproximativ +1.
- Pierdere de apă: -18,01, masa unei molecule de apă conform PubChem.
- Un aminoacid lipsă: o deplasare în jos cu masa acelui rest, adică masa aminoacidului liber minus o moleculă de apă. Pentru prolină, PubChem indică 115,063; minus 18,011, aceasta înseamnă 97,05.
De unde provin acești produși secundari în timpul sintezei se arată în Cum se produc peptidele?; cum împiedicați formarea lor în timpul depozitării se arată în Depozitarea peptidelor în laborator.
Două exemple din practică
Un nume, doi compuși. În acest catalog, TB-500 este fragmentul Ac-LKKTETQ, cu o masă moleculară de 889,0 conform PubChem. Proteina completă timozină beta-4 are în PubChem o masă de aproximativ 4963. Așadar, o măsurare de masă arată imediat care dintre cele două se află în flacon, chiar dacă eticheta folosește același nume.
Cu sau fără DAC. CJC-1295 există în două forme: cu DAC, cu o masă moleculară de 3647,2, și fără DAC, cu 3367,9. O diferență de aproape 280 nu poate trece neobservată într-un spectru.
Într-o combinație, fiecare componentă ar trebui să aibă propria masă; acesta este subiectul articolului Combinații de peptide în cercetare.
Un spectru de masă nu apare niciodată singur pe un certificat: puritatea reiese din cromatogramă, iar identitatea din spectru. Cum descriu cele două împreună un lot se explică în Ce este un COA? și Ce înseamnă o puritate de 99 %? Certificatele loturilor noastre se află pe pagina Rezultate de laborator.
Surse
Consultate în noiembrie 2026.
- The Nobel Prize in Chemistry 2002 (Nobel Prize Outreach): John B. Fenn și Koichi Tanaka, cu motivația privind metodele de ionizare prin desorbție ușoară, și Kurt Wüthrich pentru rezonanța magnetică nucleară
- Hydrogen cation (PubChem), CID 1038: masă monoizotopică 1,00783
- Sodium ion (PubChem), CID 923: 22,98977, și Potassium cation, CID 813: 38,96371
- Water (PubChem), CID 962: 18,01056, Ammonia, CID 222: 17,02655, și Atomic oxygen, CID 159832: 15,99491
- L-Proline (PubChem), CID 145742: 115,063
- BPC-157 (PubChem), CID 9941957: 1418,704 monoizotopică și 1419,5 medie
- TB-500 (Ac-LKKTETQ) (PubChem), CID 62707662: 889,0, și Thymosin Beta 4, CID 45382195: aproximativ 4963
- CJC-1295 (with DAC) (PubChem), CID 91971820: 3647,2, și CJC-1295 without DAC, CID 56841945: 3367,9
- Manning M.C. et al. (2010), Stability of protein pharmaceuticals: an update, Pharmaceutical Research (PubMed), PMID 20143256: oxidare, dezamidare și hidroliză
Acest articol oferă informații de context despre cercetarea de laborator. Nu reprezintă un sfat medical și nici instrucțiuni de utilizare. Toate produsele sunt destinate exclusiv cercetării.
