A prova de identidade num certificado de análise é uma medição de massa. Como ler uma sequência peptídica explica como calcular a massa teórica a partir da sequência. Este artigo começa onde esse termina: no próprio espectro.
O que significa o eixo dos x
Um espectrómetro de massa não mede a massa, mas a razão entre a massa e a carga: m/z. É por isso que o eixo dos x indica m/z e não daltons. Para uma partícula com uma única carga, os dois valores são quase iguais; para uma partícula com três cargas, diferem por um fator de três. Cada pico levanta, portanto, duas questões: que massa e que carga?
Duas formas de ionizar
Uma molécula tem primeiro de adquirir uma carga e passar à fase gasosa sem se desintegrar. Para as biomoléculas grandes, esse foi durante muito tempo o obstáculo. Em 2002, metade do Prémio Nobel da Química foi atribuída a John B. Fenn e Koichi Tanaka «for their development of soft desorption ionisation methods for mass spectrometric analyses of biological macromolecules»; a outra metade foi atribuída a Kurt Wüthrich por trabalhos com ressonância magnética nuclear. Fenn trabalhou com a ionização por electrospray (ESI), em que uma solução é pulverizada num campo elétrico; Tanaka mostrou que a dessorção por laser também funciona, a abordagem utilizada na MALDI.
Qual dos dois métodos o certificado indica determina o aspeto do espectro. Com electrospray, um péptido capta um ou mais protões e normalmente vê-se uma série de picos da mesma molécula.
Escadas de cargas
Um péptido protonado escreve-se [M+zH]z+: a massa neutra M mais z protões, repartidos por z cargas. O PubChem atribui ao protão (o catião hidrogénio) uma massa monoisotópica de 1,00783. Com esse valor, pode calcular o valor m/z de cada estado de carga. Tome-se o BPC-157, com uma massa monoisotópica de 1418,704 segundo o PubChem:
| Ião | Cálculo | m/z |
|---|---|---|
| [M+H]+ | (1418,704 + 1,008) / 1 | 1419,71 |
| [M+2H]2+ | (1418,704 + 2 × 1,008) / 2 | 710,36 |
| [M+3H]3+ | (1418,704 + 3 × 1,008) / 3 | 473,91 |
Funciona igualmente no sentido inverso: de um pico a m/z 710,36 com carga 2 resulta M = 2 × 710,36 – 2 × 1,008 = 1418,70. Este cálculo inverso, de m/z para a massa neutra, chama-se desconvolução. O software fá-lo, mas com dois picos e uma calculadora também se chega lá.
Monoisotópica ou média
O PubChem indica duas massas por composto. Para o BPC-157, a massa monoisotópica é 1418,70 e a massa média 1419,5. A massa monoisotópica corresponde à molécula em que cada átomo é o isótopo mais comum; a massa média tem em conta a distribuição natural de todos os isótopos e é, por isso, ligeiramente superior.
O certificado deve indicar qual das duas apresenta. Uma diferença de quase uma unidade não é um erro de arredondamento num péptido pequeno, e numa cadeia longa a diferença aumenta. Compare, por isso, sempre o mesmo tipo de massa.
Padrão isotópico
Com resolução suficiente, um pico de um péptido não é uma linha, mas um pequeno grupo. Isto deve-se ao facto de uma parte das moléculas conter um isótopo mais pesado, sobretudo carbono-13. Cada isótopo adicional torna a molécula cerca de uma unidade de massa mais pesada e, no eixo m/z, essa unidade é dividida pela carga. O espaçamento entre os picos do grupo é, portanto, de cerca de 1 com carga 1, de cerca de 0,5 com carga 2 e de cerca de 0,33 com carga 3. Assim, pode ler a carga diretamente no padrão.
Picos que não pertencem ao péptido
Nem todos os picos são impurezas. Um péptido também pode captar um ião sódio ou potássio em vez de um protão. Com os valores do PubChem, o desvio pode ser indicado com exatidão. Para o BPC-157:
- [M+Na]+ a m/z 1441,69. O sódio pesa 22,990, ou seja, mais 21,98 do que o protão.
- [M+K]+ a m/z 1457,67. O potássio pesa 38,964, ou seja, mais 37,96 do que o protão.
Outros desvios indicam uma alteração química do próprio péptido. Manning e colegas (Pharmaceutical Research, 2010) descrevem as reações subjacentes:
- Oxidação: um átomo de oxigénio adicional. O PubChem indica 15,995 para o átomo de oxigénio, ou seja, cerca de +16 por cadeia lateral oxidada.
- Desamidação: um grupo amida (NH2) passa a grupo ácido (OH). Essa diferença é exatamente a diferença entre a água (18,0106) e o amoníaco (17,0265) no PubChem: +0,98, na prática cerca de +1.
- Perda de água: -18,01, a massa de uma molécula de água segundo o PubChem.
- Um aminoácido em falta: um desvio para baixo igual à massa desse resíduo, que é a massa do aminoácido livre menos uma molécula de água. Para a prolina, o PubChem indica 115,063; menos 18,011, dá 97,05.
A origem desses subprodutos durante a síntese é explicada em Como se fabricam os péptidos?; a forma de evitar que se formem durante a conservação, em Conservar péptidos no laboratório.
Dois exemplos práticos
Um nome, dois compostos. Neste catálogo, o TB-500 é o fragmento Ac-LKKTETQ, com uma massa molecular de 889,0 segundo o PubChem. A proteína completa, a timosina β4, tem no PubChem uma massa de cerca de 4963. Uma medição de massa decide, portanto, de imediato qual dos dois está no frasco, mesmo quando o rótulo utiliza o mesmo nome.
Com ou sem DAC. O CJC-1295 existe em duas formas: com DAC, com uma massa molecular de 3647,2, e sem DAC, com 3367,9. Uma diferença de quase 280 não passa despercebida num espectro.
Numa combinação, cada componente deve ter a sua própria massa; é esse o tema de Combinações de péptidos na investigação.
Um espectro de massa nunca aparece sozinho num certificado: a pureza provém do cromatograma e a identidade do espectro. A forma como os dois, em conjunto, descrevem um lote é explicada em O que é um COA? e O que significa uma pureza de 99%? Os certificados dos nossos lotes estão em Resultados laboratoriais.
Fontes
Consultadas em novembro de 2026.
- The Nobel Prize in Chemistry 2002 (Nobel Prize Outreach): John B. Fenn e Koichi Tanaka, com a fundamentação sobre os métodos de ionização por dessorção suave, e Kurt Wüthrich pela ressonância magnética nuclear
- Hydrogen cation (PubChem), CID 1038: massa monoisotópica 1,00783
- Sodium ion (PubChem), CID 923: 22,98977, e Potassium cation, CID 813: 38,96371
- Water (PubChem), CID 962: 18,01056, Ammonia, CID 222: 17,02655, e Atomic oxygen, CID 159832: 15,99491
- L-Proline (PubChem), CID 145742: 115,063
- BPC-157 (PubChem), CID 9941957: 1418,704 (monoisotópica) e 1419,5 (média)
- TB-500 (Ac-LKKTETQ) (PubChem), CID 62707662: 889,0, e Thymosin Beta 4, CID 45382195: cerca de 4963
- CJC-1295 (com DAC) (PubChem), CID 91971820: 3647,2, e CJC-1295 sem DAC, CID 56841945: 3367,9
- Manning M.C. et al. (2010), Stability of protein pharmaceuticals: an update, Pharmaceutical Research (PubMed), PMID 20143256: oxidação, desamidação e hidrólise
Este artigo contém informação de contexto sobre investigação laboratorial. Não constitui aconselhamento médico nem instruções de utilização. Todos os produtos se destinam exclusivamente a investigação.
